27

Genom człowieka to

mat. genetyczny zawarty w haploidalnym zestawie chromosomow (n=23)

Na genom czlowieka składają się

1) DNA w jądrze, dna genomowe (gDNA) oraz 2) DNA mitochondrialny (mt DNA)

gDNA zawiera

3,08 miliardów nukleotydów

Eksony stanowią

1,5% dna

Introny stanowia

25,5 % Dna

DNA niekodujący stanwoi

73% dna

mtDNA występuje

w postaci kolistych cząsteczek w macierzy mitochondriów

Dzięki technikom klonowania staje się możliwe

uzyskiwanie dużych ilosci materialu do badan sekwencyjnych

Enzymy restrekcyjne tworzą

system obronny bakterii i sinic przed infekcją z udziałem wirusów bakteryjnych i bakteriofagów

Enzymy restrykcyjne tnące DNA w miejscu specyficznych sekwencji, dł.

Długość zależy od odległości między sekwencjami rozpoznawanymi przez enzym

Identyfikacja miejsc rozpoznawanych przez różne enzymy restrykcyjne pozwala na

skonstruowanie mapy restrykcyjnej

Nazwy enzymów tworzy się

od 1 litery nazwy rodzajowej i 2 liter nazwy gatunkowej

1 jednostka enzymu restrykcyjnego oznacza

taka jego ilosc, ktora katalizuje kompletną hydrolizę wiązan w cz. fazowego dna u masie 1ug(50kpz) w ciagu 1 godz i w temp. 37 stopni

Rozpoznawana sekwencja: ecori

5' g/aattc 3', 5' jest lepkim koncem

Rozpoznawana sekwencja: Hae III

5' GG/CC 3', powstaja tepe konce

Rozpoznawana sekwencja: HhaI

5' GCG/C 3', 3' jest lepkim koncem

ECORV Rozpoznawana sekwencja:

5' GAT/ATC 3', powstają tepe konce

Rozpoznawana sekwencja: taqI

5' t/cga 3', 5' jest lepkim końcem

Rozpoznawana sekwencja: NotI

5' gc/ggccgc 3', enzym rozpoznający 8-nukleotydową sekwencję

Lepkie końce 3' tworzone przez enzymy restrykcyjne

złożone z 2-4 nukleotydów

Lepkie końce 5' tworzone przez enzymy restrykcyjne

złożone z 2-6 nukleotydów

Izoschizomery

Enzymy pochodzące z różnych szczepów bakterii, ale rozpoznające te same sekwencje DNA

Lepkie końce

1niciowe sekwencje wystepuja na obu koncach czasteczki przeciete niesymetryczne

Fragmenty DNA powstałe po trawieniu restryktazami można

rozdzielac elektroforetycznie

Po elektroforezie, jaki rozklad dna?

liniowy rozklad otrzymanych fragmentow od najmniejszych do najwiekszych

Na tej samej wysokosci zelu znajduja się

fragmenty identycznej wielkości, co zwykle odpowiada takiej samej sekwencji nukleotydowej

Mapa restrykcyjna

wzajemne ułożenie miejsc

wzór restrykcyjny

tworzony przez wielkosc fragmentow otrzymanych po trawieniu enzymami

Ligacja lepkich/tepych koncow jest wydajniejsza?

Lepkich, bo pomiedzy komplementarnymi 1-nicowymi fragmentami lepkich k. tworza sie wiazania wodorowe, co ulatwiaja ligacje

Fragmenty DNA powstałe po cięciu okreslonym enzymem moga bzostac polaczone z innym DNA

wektorem, trawionym tym samym enzymem

Końce DNA badanego i DNA wektora

są sparowane komplementarnymi nukleotydami i mogą być łączone za pomocą ligazy

Wbudowany fragment DNA to

wstawka

Wektory autonomiczne

replikują się niezależnie od genomu gospodarza

Wektory integracyjne

włączają się do DNA gospodarza i są bardziej stabilne, ale występuja w mniejszej liczbie kopii

Wektory retrowirusowe mogą spowodobac

Wektory retrowirusowe mogą spowodobacintegracje sekwencji przenoszonej w wektorze z genomem gospodarza

Wektory ekspresyjne

zapewniają wydajną ekspresję klonowanej sekwencji

Wektory bifunkcjonalne

mogą występować w co najmniej 2 różnych organizmach, przy czym istnieje możliwoc przeniesienia wektora z komorki prokariotycznej do eu. i vice versa

Najwazniejszym elementem warunkujacym efektywnosc wektora sa

sekwencje ori, odpowiedzailne za rozpoczęcie replikacji

Jeśli wektor za wstawka bedzie namnazy w kom. bakterii lub drozdzy to musi...

posiadac sekwencję ori obydwu organizmów

Miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych powinny znajdować się

w obrębie markerów selkcyjnych MCS, co umożliwia identyfikację komórek, do ktorych wniknal zrekombinowany wektor

Plazmid to

pozachromosomowa, zwykle kolista cz. DNA, wielkosc od kilku do kilkuset t. pz, zdolna do samodzielnej replikacji

Wielkosc wstawki, plazmid

15 kpz

wielkosc wstawki, wektory fagowe

ok 25 kpz

wielkosc wstawki kosmidy

45 kpz

wielkosc wstawki PAC

150 kpz

wielkosc wstawki BAC

500 kpz

wielkosc wstawki YAC

1 000 kpz

Bakteriofagi

wirusy infekujące bakterie przez wstrzykniecie swojego DNA do wnetrza kom, bakteryjnej, stosowane jako wektory

W budowie bakteriofagów rozroznia sie

dwuniciowy dna lub rna otoczony białkiem kapsydu

fag λ

48 kpz, infekuje E. coli, wstrzykuje 2niciowy liniowy DNA do komórki, w ktorej przeksztalca sie w forme kolistą(umożliwiają to sekwencje cos znajdujace sie na koncach liniowego DNA faga)

Wektory typu replacement ("z zastąpieniem")

rodzaj wektora lambda, gdy region genomu faga podlega wymianie na obce DNA

wektory typu insercyjnego

wektory rodzaj lambda, gdzie wbudowywany fragment obcego dna zawiera się w granicach do 8 kpz

pochodnymi faga λ są

charony, centralna cz. bakteriofaga λ ktora nie jest niezbedna moze byc usunieta i zastapiona obcym DNA

Pochodne faga M13 charakteryzuje

szczególny cykl zyciowy, pozwalajacy na wykorzystanie go do wytwarzania jednonicowego DNA

M13

fag podłużny, nitkowaty, 6400pz, nie powoduje lizy, lecz jest uwalniany z zyjacych kom. bakteryjnych

Po wstrzyknieciu DNA faga m13 do komorek bakteryjnych

syntetyzowana jest druga nic DNA

Kosmid budowa

skladaja sie z sekwencji plazmidu bakteryjnego z genem ori, polaczonych z sekwencją cos faga λ, ktora jest konieczna do pakowania DNA do wnętrza kapsydów fagowych

Kosmid infekuje

komórki bakteryjne podobnie jak fag λ, a jego DNA replikuje jak DNA plazmidu

Pac

Rozbudowana wersja kosmidu, sztuczny chromosom wyprowadzony z faga p1, o wielkosci 19,5 kpz

YAC

sztuczne chromosomy drozdzy, CEN4 , TEL, ARS zostały wyizolowane i polaczone z plazmidami skonstruowanymi dla E. coli

CEN4

Sewkencje drozdzowe centromeru

TEL

sekwencje drozdzowe telomeru

ARS

miejsca poczatku replikacji

BAC

zrekombinowane DNA bazujace na DNA plazmidu F bakterii E. coli

BAC i YAC służą do

lokalizacji nowych genów i poszukiwania nowych sond DNA

Wektorami używanymi do klonowania w komorkach ssakow sa

wektory eukariotyczne oparte na wirusach.

Transformacja

wbudowania zrekombinowanego wektora do komórki gospodarza

komórki kompetentne

odpowiednio przygotowane na przyjęcie DNA

Elektroporacja

silny impuls elektryczny powodujacy przejsciowe utworzenie w bl. kom. mikroporów, przez ktore moze przenikac zrekombinowany DNA

Po transformacji bakterie wysiewa się na

odpowiednie podłoże selekcyjne. Selekcja opiera się na obecności w wektroze genów markerowych

geny markerowe w wektorze nadaja

transformantom określony fenotyp

Selekcja po transformacji, bakterie

1) umiejscowanie w plazmidzie 2 genów odporności, 2) test alfa-kompetencji

Umiejscowowienie w plazmidzie 2 genów odporności

kazdy z genow odpowiada za opornosc na inny antybiotyk, przy czym 1 z nich ma fragment do klonowania. Komorka, ktora plazmidu nie pobrala bedzie wrazliwa na oba antybiotyki.

Test alfa-komplementacji

Bakterie ktore pobrały zrekombinowy plazmid, kolor bialy. Bakterie gdzie komplemetnacja mutacji, niebieskie

Polilinkery wektorow sa umiejscowione

w obrebie genu kodujacego enzym B-galaktozydaze.

Dzięki bibliotece cDNA można uzyskac infromacje

o genach aktywnych w danym typie komórek lub tkanek

PCR odzwierciedla

naturalny proces replikacji i umożliwia powielenie wyhbranych odcinków kwasów nukleinowych

Sposoby usuwania białek (odbiałczania) preparatu

1) z zastosowaniem fenolu i chloroformu, wskutek wysolenia białek z lizatów komórek, po związaniu DNA z nośnikiem

Sposoby usuwanie białka: po związaniu DNA z nośnikiem

Używane są kolumny chromatograficzne z filtrami jonowymiennymi lub krzemionkowymi

320nm

tło i możliwe kontaminacje

Elektroforeza preparatywna umożliwia

izolację z żelu tej cz. preparatu, która jest niezbędna do dalszych prac. Do tego celu stosuje się różne techniki elucji

Elektroforeza analityczna słuzy do

charakterystyki badanego preparatu na danym etapie dośiwadczenia.

Rozkład frakcji rybosomalnych moze byc wykorzystywany jako

orientacyjny marker mas czasteczkowych, gdyzy znane sa wielkosci podstawowych frakcji

Wielkość 18s

1,9 kpz

wielkość 28s

5,0 kpz

Bromek etydyny, co robi

interkaluje pomiędzy pary zasad, powodujac intensywną fluorescencję w świetle UV

Barwienie bromkiem etydyny umożliwia wizualiację DNA w ilości

10 ng w pojedynczym brążku

Kompleks SYBr-dna ma maksiumum absorpcji... maksiumum emisji

Absorpcji: dlugosc fali 498nm(niebieski), emisji: 522nm (zielony)

Do rozdzielenia duzych czasteczek DNA, od 20 kpz do 10 mpz stosuje sie

elektroforezę w polu pulsacyjnym

Elektroforeza w polu pulsacyjnym

Pole elektryczne jest włączane i wyłączane w krotkich odstepach czasu, zmieniajac kierunek pola elektrycznego o 90 lub 180.

Elektroforeza kapilarna służy do

rozdziału niewielkich czasteczek kwasow nukleinowych; zwana inaczej elektroforezą w wolnym buforze

Podstawowe techniki wykorzystujace rozdzial w kapilarach objete sa

ogolnym pojeciem wyskosprawnej elektroforezy kapilarnej HPCE

Elektroforetyczne przenoszenie (elektotransfer)

Przenoszenie cz. kwasów nukleinowych rozdzielonych uprzednio w żelu na wiazace je nosniki

Podczas zwyklej elektroforezy prad plynie

wzdłuż łaszczyzny żelu, przyczynaiajc sie do rozdzialu czas.

W transferze elektroforetycznym prąd płynie

przez całą grubość żelu przyczyniając się do efektywnego przeniesienia cz. z żelu na bibułę lub różne rodzaje membran nałożonych n ażel.

Transfer na membrany można przeprowadzić z wykorzystaniem

sił kapilarnych

Hybrydyzacja to

tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochadzącymi z różnych źródeł. Dna najczęściej bada się w postaci fragmentów pojedyczych nici.

Sonda molekularna

Druga część powstającej hybrydy znajdujaca sie w roztworze hybrydyzacyjnym

Sondami molekularnymi moga byc

fragmenty 1-niciowego dna/rna/cdna, syntetyczny oligonukleotyd, sonda utworzona dzieki amplifikacji PCR

Sondy można znakować

radioaktywnie, nieradioaktywnie, immunochemicznie, enzymatycznie

Wykrycie sygnały sondy po hybrydyzacji jest możliwe

dzięki jej znakowaniu.

Znakowanie sondy: radioaktywnie

do sondy włączany jest nukleotyd znakowany radioaktywnym izotpoem, detekcja opiera się na naświetlaniu klisz wrażliwych na promieniowanie w procesie autoradiografii

Znakowanie sondy: nieradioaktywnie

np. metodami fluorescencyjnmi, za pomocą emisji swiatla o okreslonej dlugosci fali i roznego typu fluorochromów

Znakowanie sondy: immunochemicznie

do sondy włącza sięnukleotyd sprzężony z haptenem(biotyna, digoksygenina, fluoresceina)

Znakowanie sondy: enzymatycznie

do sondy włączany jest nukleotyd sprzezony z czasteczka enzymu

Hybrydyzacja in situ wykorzystywana

do rozmazów komkórkowych lub skrawków tkanek po ich odpowiednim przygotowaniu celem odsłonięcia i denatruacji kwasów nukleinowych, a tym samym uzyskania mozliwosci laczenia sie ich nici z sek. komp. sondy

Dot blot

Odmiana Southern, pozwala na jednoczesne wykrywanie i identyfikację wielu probek DNA na tym samym filtrze

Slot blot

zamiast nakrapiania na membranę, stosuje się specjalnie przygotawny wzorzec szczelin, do ktorych nanosi sie DNA

slot blot może byc wykorzystywana

jako analiza ilościowa przy założeniu wprowadzenia przed hybrydyzacją wzorców ilości użytego DNA

Hybrydyzacja kolonijna

na membranie umieszcza się kolonie bakteryjne zawierające poszczególne klony. Po transformacji komórek bakteryjnych zmodyfikowanym plazmidem i wysianiu na szalki Petriego replikuje się kolonie na filtr.

Co po replikowaniu koloni na filtr? hybrydyzacja kolonijna

poddaje się hybrydyzacji i autoradiogrofii

Hybrydyzacja łysinkowa

Po transformacji komórek bakteryjnych wektorem fagowym i wysianiu ich na szalki petriego replikuje się na kolonie na filtr.

Co po przeniesieniu koloni na filtr? hyb. łysinkowa

Przytwierdza się przeniesione fagi do filtru i hybrydyzuje z sondą, a nastepnie poddaje autoradiografii.

Makromacierze, działanie

naniesienie na nosnik licznych wzorcowych sekwencji bedacych podłożem do hybrydyzacji materiału badanego.

Mikromacierze ekspresyjne zawierają

11-20 sond oligonukleotydowych obejmujących fragmenty 3' kazdego ze znanych transkryptow danego organizmu

Mikromacierze eksonowe zawierają

sondy homologiczne dla poszczególnych eksonów danego transkryptu

Mikromacierze dachówkowe (równomiernie pokrywające genom) umożliwiają

identyfikację miejsc wiązania sie czyn. transkrypcyjnych, modyfikacji histonow, metylacji Dna i inne zwiazane z reg. transkrypcji.

Chip-chip pozwala na

jak czesto i w jakich miejscach genomu wiązane są konkretne białka, co stwarza mozliwosc stowoistego mapowania interakcji bialko-DNA.

PRINS

synteza in situ przy udziale startera.

Princs, jak działa

Hybrydyzacja nieznakowana sondą z wykrywaniym od. kwasu nuklei., a nastepnie wprowadza się polimerazę DNA i znakowane nukleotydy.

Diagnostyka preimplantacyjna blastomerów uzyskanych drogą biopsji zarodka, co się uzywa, jakich metod?

PRINCS i pcr

Mikromacierze wykorzystywane do:

analizy trasnkryptomicznej(RNA), badania: DNA, sekwencji genów, oddziaływania DNA z białkami, modyfkiacja chromatyny chip-chip, analiza SNP

CGH nie!!! może służyć do

wykrywania aberracji zrównoważonych (tylko niezrównoważone)

mikromacierz CGH (array CGH), czym sie rozni od CGH?

Zastąpiono chromosomy metafazowe oligonukleotydami lub grafmentami DNA(jak bac/pac)

CGH mechanizm działania

na szkiełku utrawala prawidłowo dzielące się komórki, z kom. badanych izoluje się DNA, to DNA hybrydyzuje się w mieszaninie z DNA kontrolnym 1:1

W technice RT-PCR reakcję poprzedza

przepisanie sekwencji zawartej wyłącznie w dojzałym mRNA, a wiec powstalym tylko na bazie eksonow, na cDNA.

EST

znaczniki ekspresji; kopiujac mRNA uzyskuje sie kilkusetnukleotydowe fragmenty DNA, z ktorej mRNA byl transkrybowane

EST reprezentują

znaną, unikatową sekwencję klonu cDNa

IVTT = PTT

test syntezy białka in vitro, służy do badania produktu reakcji RT-PCR

RAPD-PCR

technika losowej amplifikacji polimorficznego DNA

RAPDpPCR umożliwia

równoczesną detekcję polimorfizmu wielu loci w całym genomie

w LCR stosuje się

powielanie in vitro fragmentu kwasu nukleinowego w wyniku wielokrotnego powtórzenia reakcji ligacji 2 oligonukleotydów

Metoda LCR pozwala na

analizę mutacji genów

Różnica między PCR a LCR

zastosowanie w LCR 4, a nie 2 starterów + posiada termostabilną ligazę

MLPA

Reakcja łańcuchowej polimerazy, pozwalającą na względnie równoczesną i ilościową ocenę do czterdziestu sekwencji nukleotydowych.

HRM

analiza krzywych topnienia DNA. Jeśli mutacje, krzywa topnienia ma nieco inny przebieg niz prawidłowa.

W MLPA amplifikacji ulega

sondy, które podlegają hybrydyzacji z badanym fragmentem DNA, a nastepnie ligacji.

MLPA- po ligacji

powstają matryce do reakcji multipleks PCR. W przypadku delecji 1 z alleli uzyskuje się o 1/2 mniejszą ilośćmatrycy.

MLPA - 1 sonda każdej pary zawiera

między sekwencją komplementarną do badanego DNA dodatkową sekwencję, tzw. łącznik

MLPA - w każdej z poszzcególnych par sond, sekwencja łącznika...

ma różna, zdefiniowaną długość, co umożliwia w czasia rozdział elektroforetyczny i identyfikację fragmentów na podstawie ich długości.

GAP-LCR

odmiana LCR, gdzie stosuje się jednoczesnie ligazę i polimerazę DNA

w reackji GAP-LCR między oligonukleotydami hybrydyzujacymi z dna powstaje

przerwa, ktora zostaje uzupelniona przy udziale polimerazy DNA.

PCR-SSCP

Analiza polimorfizmu konformacji pojedynczej nici. Obie nici poddaje się denaturacji.

PCR-DGGE

Zamiast denaturacji przed rozdziałem elektroforetycznym badanej cz. DNA mozna zastosowac czynnik denaturujacy zawarty bezposrednio w zelu

PCR-TGGE

Zamiast denaturacji przed rozdziałem elektroforetycznym badanej cz. DNA gradient temperatury jako cz. denaturujacy

HA

analiza heterodupleksów

CMC

chemiczne rozszczepianie niesparowań heterodupleksów

Odmianą HA jest

denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa DHPLC

DHPLC wykorzystuje

wysoka rozdzielczosc nowoczesnych wyplenien kolumn chromatograficznych, czulosc siega 100%

pirosekwencjonowanie

na kazdym etapie syntezy dna jest inkubowane w obecnosci: polimerazy DNA, sulfurylazy ATP, luferyrazy i apyrazy

Sekwencjonowanie 454

wykorzystywanie równoległego pirosekwencjonowania wielu fragmentów DNA w tym samym czasie.

SMRT

Wykorzystuje pojedyn.cz. polimerazy DNA w trybie ciągłym.

Marker

wyznacznik, dowolna, genetycznie kontrolowana cecha fenotypowa

Marker genetyczny

każdy określony fragment DNA, białko, lub fenotyp

Mapa genomu

oparta na częst. rekombinacji i analizy sprzezen

Markery molekularne(dna)

mapowanie cech sekwencji nie będących sekwencjami genów

Markery genetyczne i molekularne nalezy odróżnic od =/=

wzorcow masowych DNA podczas elektroforezy i od chromosomow markerowych

Jak nie mozna nazwac chromosomow markerowych?

Markery, nie wolno!!!

Markery molekularne związane z niekodującym DNA dzieli się na

polimorfizm sekwencji 1) anonimowych, 2) mini i mikro satelitarnych

DNA fingerprinting

Badanie sekwencji repetytywnych niezbędnych do celów kryminalistycznych

Fingerprinting przez amplifikację DNA - DAF polega na

amplifikacji DNA z użyciem 8-10 nukleotydowych starterów i następnie rozdziale produktów reakcji PCR w denaturujacym żelu poliakrylamidowym

Każdy SSLP może mieć

wiele różnych wariantów długości, co oznacza wieloallelowośćw odróżnieniu od RFLP

SSLP

szeregi powtórzen sekwencji o roznej dl. zawierajacych rozna liczbe jednostek powtarzalnych

Typy SSLP

VNTR i STR

VNTR jednostka powtarzalna ma

kilkadziesiat nukleotydów (10-100 bp)

Technikę VNTR najczęściej stosuje się w technikach...

ustalenia ojcostwa.

Allele mikrosatelitów są

kodominujące i dziedziczone w sposób mendlowski.

Typowe loci mikrosatelitarne zawierają

10-30 (maksymalnie 50) powtórzen motywu i osiagaja długosc 100 do 400 bp.

VNTR, jednostka powtarzalna ma

klikladziesiąt nukleotydów (10-100bp)

TechnikaVNTR zostałą wyparta przez

analizę polimorfizmu krótkich powtórzen tandemowych STR

STR stosuje sie przy badaniu

powtórzen tandemowych (tg)n i (ca)n

Typowie loci mikrosatelitarne zawierają

10-30 powtórzen motywu i długosc 100 do 400 bp

Najszybszym sposobem oznaczania polimorfizmów dł. mikrosatelitarnych jest

Reakcja PCR

SSR

obejmuje analize DNA mikrosatelitarnego, obecnego we wszystkich genomach różnych organzimów

SAMPL

Połączenie AFLP i SSR. Amplifikowane odcinki DNA znajdujace się miedzy miejscem rozpoznawanym przez enzym res. a sekwencją mikrosatelitarną.

RFLP

Marker, polimorfizm dł. fragm. restrykcyjnych, char. wariant określonego genu

RAPD

marker, losowo amplifikowany polimor. DNA, char. genom

AFLP

marker, polimorfizm dł. amplifikowanego fr., charakteryzuje genom

SAMPL

selektywnie amplifikowany polimorfizm loci miikrosat.

SAMP wypiera

klasyczny AFLP ponieważ generuje prążki o bardzo wys. polimorfizmie i umożliwia wykrycie alleli kodomnujących

SNP

polimorfizm poj. nukleotydu, charakteryzuje wariant określonego genu lub polimorfizm sek. niekodującej

STS

miejsce znaczone sekwencyjnie; identyfikacja chromosomow lub ich regionów

SSR

amplifikowane sekwencje mikrosat, analiza genotypów

W technice PCR powiela się

wybrany fragment DNA