Wejściówka 2

Ludzie hetero-czy mono zygotami i jak długi jest ich łańcuch genowy

są heterozygotami oraz mają dłigośc 1/500 pz

SNP

single nucleotide polymorphism

CNV

copy number variation

HGP

human genome project

pozbawienie zwierzęcia doświadczalnego określonego genu

knockout genowy

genomika porównawcza

porównawcza analiza różnych genotypów

proteomika

wiedza o zespołach białek wytwarzanych przez komórki, tkanki, narządy

transkryptomika

badania regulacji ekspresji genów na poziomie transkrypcji

Rekombinacja DNA in vitro jest możliwa dzięki?

enzymom restrykcyjnym Endonukleazy

Gdzie znaleziono Endonukleazy?

Znalezione jedynie w komórkach bakterii i sinic

Czemu zapobiegają Endonukleazy u bakterii i sinic?

Zapobiegają włączenie obcego DNA do genomu bakterii

Jaką długość ma sekwencja zwykle rozpoznawana przez Endonukleaze?

specyficzna sekwencja dwuniciowego DNA ma zwykle długość 4-8 par zasad

Aktywność „star” Endonukleaz co oznacza?

Oznacza to ze trzeba zwrócić uwagę na warunki oznaczone przez producenta gdyż b uzyskać oczekiwany efekt trzeba przeprowadzić reakcje w warunkach podanych przez producenta

w jakiej długości światła są wykrywane zasady aromatyczne

światło o długości 260 nm

w jakiej długości światła są wykrywane Białka

światło o długości 280 nm

Od czego zależy współczynnik ekstrakcji

od długości badanej cząsteczki

Absorpcja największa jest dla czego a najmniejsza dla czego

Absorpcja największa dla nukleotydów a najmniejsza dla dsDNA

Hipochromizm

Mniej barw

DsDNA o stęż 1mg/ml - A260

20

RNA i ssDNA - A260

25

Co ma wyższy współczynnik ekstrakcji puryny czy pirymidyny

Puryny mają wyższy współczynnik ekstrakcji niż pirymidyny

Co powoduje topnienie (ogrzewanie)

40% wzrost absorbancji

Co powoduje szybkie ochładzanie?

minimalny spadek absorbancji

Co powoduje wolne ochładzanie?

absorbancja bez zmian

Co daje Wektor

zdolność do izolacji od gospodarza i replikacji

Co daje wektor Fag λ

klonowania większych fragmentów

Co daje wektor H13

klonowania fragmentów jednoniciowych

Co to kosmid

plazmid + fag λ

Episomalne plazmidy

wektory dla drożdży

Plazmid Ti

dla roślin

Biblioteki DNA

zbiory sklonowanych przypadkowo fragmentów genomu DNA/cDNA

Mapowanie restrykcyjne

analiza fragmentów klonu po cięciu restryktazami

Komórki kompetentne

czyli takie, które są zdolne do przyjęcia obcego DNA przez działanie na nie jonami Ca2+, Mn2+ i Rb2+

Transformanty

przechowywane są najpierw w płynnej pożywce z antybiotykiem (selekcja) a następnie zamrażane z glicerolem (nie tworzą się kryształy) → tzw. zapas glicerolowi

Co pozwala odnaleźć polarność klonów cDNA

Rejon kodujący

W czym są umieszczone polarne startery?

Są umieszczone w postaci oligo(dT)

Polarne startery są komplementarne do?

poliA

W klonach genomowych jakie mamy geny?

Nie wiadomo od razu gdyż obecność genów nie jest oczywista

W klonowany genomach wiemy o jego polarności?

Nie za bardzo gdyż polarność nie jest oczywista w klonowanych genach

Hybrydyzacja i mapowanie pozwana nam określić?

Organizowanie klonowanych genów

na podstawie czego przygotowuje się Sondy

na podstawie Southerna części sekwencji cDNA

Co można wykazać na podstawie Sondy przygotowanej metodą Southerna?

Można określić która część klonu genomowego zawiera sekwencje komplementarne do sond.

Mapowanie za pomocą nukleazy S1:

Identyfikacja końca 3’/5’ - hybrydyzacja transkryptu z dłuższym antysensownym fragmentem na jednym końcu Usuwanie fragmentów jednoniciowych - poddanie hybryd działaniu nukleazy S1 Określanie wielkości pozostałych dwuniciowych fragmentów - elektroforeza

Wydłużanie startera

Starter jest wydłużany przez polimerazę dopóki nie osiągnie końca matrycy Następnie dochodzi do oddysocjowania polimerazy Długość wydłużonego fragmentu wskazuje na koniec 5’ matrycy

Retardacja żelowa

Zmieszanie ekstraktu białkowego ze znakowanym fragmentem DNA Rozdział mieszaniny w niedenaturującym żelu poliakryloamidowym Ujawniają się kompleksy DNA-białko w postaci prążków retardacyjnych (opóźnionych)

Technika „odcisku stopy” z udziałem DNazy I

„Odcisk stopy” białka związanego specyficznie z sekwencją DNA Może zostać ujawniony poprzez działanie małą ilością DNazy I na mieszaninę DNA i białka poddaje się analizie elektroforetycznej

Geny reporterowe

Łatwo wykrywalne geny,

W jakim celu przyłącza się geny reporterowe?

W celu zidentyfikowania funkcji jakiegoś promotora

Po przyłączeniu geny reporterowego co się bada

Bada się ilość powstałego produktu białkowego

Jak określimy ważność poszczególnych sekwencji?

poprzez dokonywanie progresywnych delecji DNA z jednego końca

Co pozwala uzyskać jednokierunkowe delecje?

Egzonukleaza III - Usuwa kolejne nukleotydy w kierunku 3’→5’, gdzie koniec 3’ w dwuniciowy DNA jest cofnięty w stosunku do 5’

łączenie fragmentów sekwencji

Powstałe cząsteczki poddaje się ligacji

Mutageneza ukierunkowana?

Uzyskiwanie zmian jednego lub kilku nukleotydów w określonym miejscu sekwencji

Jak przeprowadza się mutagenezę

W tym celu wykorzystuje się przyłączanie mutagennego startera i syntezę komplementarnego DNA z użyciem polimerazy DNA

Mutageneza dawniej

Dawniej - jednoniciowe matryce przygotowane z użyciem wektorów M13

Mutageneza obecnie

Obecnie - matryce otrzymane metodą PCR

Cel mutagenezy metodą PCR

amplifikacja fragmentów DNA od strony 5’ lub 3’

Zastosowanie klonowania

Wytwarzanie: zrekombinowanego białka, GMO, „odcisku DNA”, przygotowywanie zestawów diagnostycznych, terapie genowe

Jak powstaje zrekombinowane białko

może być produkowane dzięki wprowadzeniu genu rzadko występującego białka do plazmidu i poddanie ekspresji w bakteriach, gdy krytycznym etapem jest modyfikacja potranslacyjna, gen może być poddany ekspresji w kom. eukariotycznych

Jak powstaje GMO

powstaje poprzez wprowadzenie obcy gen do komórki, z której można zregenerować cały organizm

Jak powstaje „Odcisk DNA”

hybrydyzacja, przeniesionego metodą Southerna, genomowego DNA z sądami, które rozpoznają proste powtórzenia nukleotydów prowadzi to do otrzymania obrazu, który jest unikatowy dla danego osobnika i może być stosowany do jego identyfikacji.

Terapia genowa - próby skorygowania genetycznych zaburzeń przez wprowadzenie do organizmu pacjenta prawidłowej kopii genu

próby skorygowania genetycznych zaburzeń przez wprowadzenie do organizmu pacjenta prawidłowej kopii genu

Czystość DNA

A260/A280 = 1,8 -czyste DNA A260/A280 < 1,8 -zanieczyszczone białkiem A260/A280 > 1,8 -zanieczyszczone RNA

Wirowanie izopikniczne

To inaczej równowagowe wirowanie w gradiencie stężeń chlorku cezu

Co umożliwia Wirowanie izopikniczne

Umożliwia analizę DNA i jego oczyszczanie

Co z RNA i białkami podczas wirowania izopiknicznego?

RNA w dół, białka flotują = unoszą się

elektroforeza mikrokapilarna

z wykorzystaniem macierzy

elektroforeza kapilarna

w wolnym buforze, niewielkie cząsteczki, w cienkiej kapilarze kwarcowej

elektroforeza w żelu poliakrydynowym

5-1000 pz (gRTPCR)

elektroforeza W żelu agarozowym

0,1 -20 kpz

elektroforeza W polu pulsacyjnym

20kpz - 10 Mpz (oddziela cząsteczki wielkości 100 kpz!)

Choroba Takahary = alaktazemia

Gen kontrolujący syntezę katalazy - krótkie ramię chromosomu 11 - 11p13

Mechanizm Choroba Takahary = alaktazemia

redukuje aktywność katalazy

objawy Choroba Takahary = alaktazemia

Owrzodzenia śluzówek jamy ustnej, podudzi oraz wczesne wypadanie zębów

gdzie najczęsciej występuje Choroba Takahary = alaktazemia

Najwyższa częstość występowania mutacji w Japonii

Dziedziczenie Choroba Takahary = alaktazemia

autosomalnie recysywnie

Wrażliwość na chlorek suksametonium -

zwiotczenie mięśni, efekt szybki ale tez szybko znika(za hydrolizę sukcynylocholiny odpowiedzialnej za objawy odpowiada cholinoesteraza- jej gen na 3 chromosomie i tam mutacja)

Hipertermia złośliwa

przez leki znieczulenia ogólnego: antyestetyki, zwioty, glikozydy naparstnicy. Wzrasta napięcie mięśni prążkowanych, drżenie mięśniowe, tachykardia, wzrost temp. ciała (1C w ciągu 5 min) Mutacja 19q13.1

Alaktazemia

gen 11p13, autosomalna recesywna

Metabolizm alkoholu etylowego- 2 enzymy

dehydrogenaza alkoholowa ADH (chromosom 4) i dehydrogenaza aldehydowa ALDH (1-chromosom 9, 2-chromosom 12) Najczęściej u Azjatów

Porfirie

porfiryny to prekursory hemu i składniki enzymów: wątrobowe i erytropoetyczne. Deficyty enzymów biorących udział w przemianach porfiryn. OPP=> wątrobowe. Autosomalnie dominująco.

Krzywica oporna na wit D3

gen VDR dominująco w sprzężeniu z chromosomem X

Niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej

chromosom X

Niedobór alfa-1-antytrypsyny

gen PI, chromosom 14,

Niedobór paraoksonazy

gen PON1 na chromosomie 7 sprzężony z genem CFTR

Hemochromatoza

gen HFE na chromosomie 6, autosomalnie recesywnie

Hipolaktazja

3 allele na chromosomie 3

Fenyloketonuria

autosomalnie recesywnie, 12q24.1

Co wywołuje ostrą porfirię?

Leki (barbiturany, sulfonamidy, przeciwbólowe, antykoncepcyjne, antybiotyki, alkaloidy sporyszu, etanol), infekcje, głodzenie, duży wysiłek fizyczny.

Formy enolowe/ketonowe

W pH obojętnym - ketonowa, w zasadowym - enolowa

Co to sonikacja?

Działanie ultradźwiękiem o dużej intensywności na DNA co prowadzi do uszkodzenia DNA i zmniejszenia jego lepkości.

Podział zasad.

Puryny: adenina i guanina (2 piescienie) Pirymidyny: cytozyna, tymina, uracyl (1 pierścień)

Liza alkaliczna (element minizolacji plazmidów)

Metoda oczyszczania plazmidowego DNA z chromosomowego DNA i innych

Plazmidy

Autonomiczne, pozachromosomowe elementy genetyczne W postaci kolistych/liniowych cząsteczek DNA

PCR - łańcuchowa reakcja polimerazy

Do amplifikacji sekwencji DNA Z użyciem pary oligonukleotydowych starterów Każdy jest komplementarny do jednego końca docelowej sekwencji DNA Termostabilna polimeraza DNA powoduje wzajemne wydłużanie się ku sobie starterów

Etapy PCR

Etapy: denaturacja (95°C), przyłączenie startera (55°C), polimeryzacja (72°C) Elementy wymagane: matryca, startery, bufory, enzym, Mg2+, dNTP

Startery PCR

Startery: para oligonukleotydów o długości 18-30 pz i podobnej zawartości G+C

Enzymy PCR

termostabilna (odporna na denaturację) polimeraza DNA np. Taq