Wektory

Plazmidy bakteryjne 1

=ds, koliste,=potrzebują enz. Gosp do repl i transkr =często geny korze dla gosp np. odp na antyb = poch od pMB1/ColiE1 (ori i przyległe sekwencje) =zwykle 1 replikon -mogą być przekaz do innych bakt podczas koniugacji

Plazmidy bakteryjne 2

=markery selekcyjne odp na amplicyline(mają plazmid przeżyja dodanie antyb) =geny reporterowe – wizualnie rozróżnić bakt z plazm przez świecenie =syst ekspresji

Plazmidy bakteryjne najważniejsze elementy

-gen markerowy (odporności) -miejsce klonowania -ori – origin of replication W posiewach redukcyjnych najlepiej uzywać pojedynczych kolonii gdyż są one najbardziej homologiczne.

Bakteriofag lambda

- posiada główkę i ogonek Główka z kilku rozdajów białek zawiera wewnątrz jego genom – ok 50 kpz, cząsteczka dwuniciowa liniowa. Ogonek zbudowany z innych białek. – jest to rodzaj pasożyta

Cykl rozwojowy faga lambda cz1

Przył się do b wykr maltozę u bakt. Wstrzyk DNA do jej wnętrza. Genom długie lepkie końce, zamyka się w kółko wew bakt, enzymy bakt je sklejają. Geny zaczynają działać

Cykl rozwojowy faga lambda cz2

powst mRNA, b kapsydu, namn się wirus, do przepeł się kom i obumarcia

Cykl rozwojowy faga lambda cz3

(szlak lityczny bo do lizy kom. Częściej wyk w bibli bo nie trzeba wycinać naszych pożądanych genów z genomu bakt, tylko mamy genom wirusa z naszym dokl fragm)(Może też zintegr się z chr. bakt i się z nim dzielić – szlak lizogeniczny)

Łysinka fagowa

zdechłe bakterie i bakeriofagi. Brak zmetnienia bo brak rosnących zdrowych bakterii

Lambda jako wektor wady:

• długi genom • za dużo miejsc restrykcyjnych (w tym w enach istotnych dla litycznego rozwoju) trudno wklonować • kapsyd nie pozwala na upakowanie cząstek większych niż 105% i mniejszych niż 78% genomu dzikiego faga lambda)

Lambda jako wektor usuwanie wad

• usuwane środkowej części nieistotnej dla wzrostu litycznego (wektor tpu substytucyjnego) i wstawianie w o miejsce obcego DNA • mutowanie miejsc restrykcyjnych • wprowadzanie markerów genetycznych

Kosmidy

zmod plazmidy z sekwencją cos umozliwiające pakowanie DNA do otoczki faga lambda (pusty ok 5 kpz) Pierwotnie przeznaczone do klonowania dużych fragmenów genomowego DNA

Kosmidy cechy 1

• wektor posiada ori i geny odporności i bez insertu można go wytransformowac namnażać jak plazmid • wektor z insertem pakuje się do otoczki i transferuje się bakterie

Kosmidy cechy 2

• selekcja na antybiotyku wzrost w postaci kolonii bakteryjnych • max 47 in33 kb (pojemność otoczki lambdy) • klonowanie trudniejsze niż lambda stosowany tylko w szczególnych przypadkach

Kosmidy stężenie

Przy niskim c cz DNA w probówce jest większe p-stwo że cz zamkn się w postać kolistą. Jak większe to będą powstawały długie linearne cz przyp konkatamery. Dzięki sekwncjom cos możemy zmusić wpakowanie ich do kapsydu (jak mają dobrą długość)

Bakeriofagi jednoniciowe 1

• jednoniciowe koliste DNA 6,4kb (M13 forma infeekcyjna) • możliwość otrzymania dużych ilości jednoniciowego dna (do sekwencjonowania, do robienia sond niciowo-specyficznych, mutageneza kierowana)

Bakeriofagi jednoniciowe 2

• pakowanie podczas wyrzycania za kom gosp – otoczka układana wokół DNA nie ma ograniczenia wielkości kawałka pakowanego • ainfekowane bakerie z wirusem to rosną 2 x wolniej

Bakeriofagi jednoniciowe wzrost na podłożu

Widzimy je jako mętne łysinki (ale troche mniej. Przez to że są obciążone wirusem to rosną 2 x wolniej

Fagmidy

• połączenie cech plazmidów i fagów • namnażanie w postaci faga’

System fagigin 1

Cz bakteriofaga z sekw cos na końcach. W środku ma sekw fagmidu plus baktryjne orii Zlinearyzowany wektor z lepkimi końcami. Zlepiamy go z naszym DNA i dostajemy fagmid i pakujemy go do główki.

System fagigin 2 Wysianie

Może być wysiany gęsto na szalce, wyrosną łysinki i możemy go mocno upakować. W zalezności od szczepu bakt możemy zrobic różne rzeczy potem.